Introduction: Cultivating in Test Tubes! / Como Cultivar En Tubos De Ensayo!

Picture of Cultivating in Test Tubes! / Como Cultivar En Tubos De Ensayo!

I've always been interested in microbiology, microcultivation and hydroponic cultives, but I couldn't help but notice that there isn't a lot of information for the "small scientist", so I've decided to do some experiments on my own.
These are the results, tell me what you think!

IMPORTANT: This involves working with fire and flammable things, if you're a minor, do it in company of your parents or someone responsible.

Siempre estuve interesado en la microbiología, microcultivos y cultivos hidropónicos, pero nunca pude encontrar información clara y util para el "pequeño científico", por lo que decidí realizar algunos experimentos.
Estos son los resultados, diganme que piensan!

IMPORTANTE: Esto involucra trabajar con fuego y cosas inflamables. Si sos un menor, hacelo en compañía de tus padres o alguien responsable.

Step 1: Materials / Materiales

Picture of Materials / Materiales

These are the materials I've used:

- Test tubes: As you can see from the pictures, I've used the ones with threaded caps. It's important to have a way to seal them, but you can use cotton plugs instead if you have conventional tubes.

- Pressure Cooker: This would be the ideal thing, but it's not really common to have one and, as you'll see, I don't. I've used an aluminum pot with an almost hermetic lid.

- Agar-agar: Is the medium where we will put the seeds. It's made of algae, that's why the vegetarians use it as a replacement for the conventional gelatin. You can also use tasteless colorless gelatin, but the agar-agar would stay solid at higher temperatures than the gelatin. This is important because you should keep the tubes in a warm place, and if the gelatin liquefies, the seed will end in the bottom of the tube.

- Fertilizer: As we said before, the agar-agar is made of algae, but it's not very "tasty" for the plants to grow in, so we will make it tastier with a few drops of fertilizer.

- Seeds: Yep, the whole idea is to germinate some seeds, right? You can buy them or collect them from the actual plants. You may also want to find if the seeds have some special requirements prior the sowing. In my case I've used red tomato and red pepper.

- A flame: The ideal would be a Bunsen burner, but then again, not everyone has one of those. The alternatives are a alcohol burner, a torch or, more simple, a kitchen burner.


Estos son los materiales que usé:

- Tubos de ensayo: Como pueden ver en las fotos, usé unos con tapa a rosca. Es importante poder sellarlos de alguna manera, pero en el caso de los tubos de ensayo convencionales se pueden usar tapones de algodón.

- Olla a presión: Esto sería lo ideal, pero no es común que cualquiera posea una olla a presión y, como verán, yo no tengo. En mi caso usé una cacerola de aluminio con una tapa casi hermética.

- Agar-agar: Es el medio donde pondremos las semillas. Esta hecho de algas, razón por la cual los vegetarianos la usan como reeplazo de la gelatina convencional. Se puede también usar gelatina sin sabor ni colorantes, pero el agar-agar se mantendrá sólido a temperaturas más altas que la gelatina. Esto es importante ya que los tubos deben conservarse en algún lugar cálido y si la gelatina se licua, la semilla caerá al fondo del tubo.

- Fertilizante: Como dijimos antes, el agar-agar está hecho de algas, pero no es muy "apetecible" para las plantas, por lo que le agregaremos algunas gotas de fertilizante.

- Semillas: Parte esencial, ya que la idea es germinar algo en este medio, no? Pueden ser compradas o recolectadas de la planta. Depende el caso, puede convenir buscar información acerca de los requerimientos de alguna semilla en particular previos al sembrado. Yo usé tomates rojos y pimientos rojos.

- Una llama: Lo ideal sería un mechero Bunsen pero, nuevamente, no cualquiera tiene uno de estos. Las alternativas son un mechero de alcohol, un soplete o, más simple, la hornalla de la cocina.

Step 2: Preparing the Medium / Preparacion Del Medio

Picture of Preparing the Medium / Preparacion Del Medio

I have 10 ml tubes so I've used 5 ml per tube. Just because I had a lot of tubes, I've made this experiment simultaneously in 50 tubes, so I needed 250 ml of medium.
It's important to read the instructions of the agar-agar or gelatin you bought. In my case, I've used agar-agar from the brand "Patagonia Argentina", made in my country. I've used 2 grams for 300 ml of medium (it's always better to prepare a little more, just in case). In this particular case, you should dissolve the agar-agar in half the volume of cold water, add then the other half volume of boiling water and put it on low fire, maintaining the boiling. This is the time to add the fertilized, about 2 ml per liter (about 40 drops). After 10 minutes (watch the foam!), you should replace the evaporated volume with water, to 300 ml, and it's ready to pour in the tubes. Once it's done, replace the cap or plug and that's it, first step accomplished!

Yo usé 5 ml de medio por tubo ya que tenía tubos de 10 ml. Ya que tenía muchos de estos tubos, decidí realizar el experimento simultaneamente en 50 tubos, por lo que necesitaba 250 ml de medio.
Es importante leer las instrucciones del agar-agar o gelatina que hayan comprado. En mi caso, usé agar-agar de la marca "Patagonia Argentina", hecho en mi país. Usé 2 gramos para 300 ml de medio (es mejor siempre preparar un poco más, por las dudas). En este caso particular, se disolvió el agar-agar en la mitad del volumen de agua fría y se le agregó la otra mitad de agua hirviendo. Se dejó a fuego bajo, manteniendo el hervor. Ahora sería el momento de agregar el fertilizante, aproximadamente 2 mililitros por litro (unas 40 gotas). Luego de 10 minutos (cuidado con la espuma!) se agregó el volumen de agua evaporado, llevandolo nuevamente a 300 ml, y ya está listo para repartir en los tubos.
Una vez listo hay que taparlos o colocarles el tapón y listo, primer paso terminado!

Step 3: Sterilization / Esterilizacion

Picture of Sterilization / Esterilizacion

Now is time to sterilize everything. Why is this important? Well, the "spiced" agar now is very attractive, not only for the seeds but for bacteria and, specially, fungus. The idea here is to destroy all the contamination that is already in the medium and keep it sterile.

IMPORTANT: If you're not going to do the seeding immediately, you can keep the tubes closed on the fridge, but ONLY after the sterilization. You should sterilize them right after the pouring or else the bacteria and fungus will grow and eat and deplete the nutrients.

To do this, fill the pressure cooker, pot or whatever you're using with some water, place the tubes inside, STANDING (the agar-agar will liquefy so they shouldn't be horizontal) and with the cap on BUT LOOSE, not firmly closed (if you're using cotton plugs, it's already OK, the cotton allows the vapor to travel) and place it on low fire. In the case of the pressure cooker, you should time 15 minutes since the valve releases pure water vapor (not air). In this way, you're sure that the tubes will be sterile. If you don't have a pressure cooker, leave it in the pot closed for around the same time, remember that it should also have some way to release the vapor to avoid high uncontrolled pressures. I did it this way and I had a 16% occurrence of fungus (and in some cases, the seed grew anyway). After the procedure is done, open the pressure cooker or pot and, if you're using threaded cap tubes, close them firmly as soon as possible. Allow them to cool at room temperature and that's it!

Note: As you'll see in the pictures, my tubes aren't completely vertical, because my pot doesn't allow me to do that, so I had keep them inclined raising the caps, to avoid loosing agar-agar.

Ahora es tiempo de esterilizar todo. ¿Por qué es importante? Bueno, el agar "condimentado" ahora es muy atractivo, no solo para las semillas, sino también para las bacterias y, especialmente, los hongos. La idea es destruir toda la contaminación que existe actualmente en el medio y mantenerlo estéril.

IMPORTANTE: Si no se va a realizar el sembrado inmediatamente, se pueden mantener los tubos cerrados en la heladera, pero SOLAMENTE luego de haberlos esterilizado. Debería realizarse la esterilización luego de dispensar el medio en los tubos, de lo contrario las bacterias y hongos crecerán y se comerán los nutrientes del medio.

Para realizar esto, agreguen un poco de agua en la olla a presión, cacerola o lo que sea que estén usando, coloquen los tubos dentro PARADOS (el agar-agar se va a licuar por lo que no deben estar horizontales) y con la tapa puesta pero NO FIRMEMENTE CERRADA (si están usando tapones de algodón no es necesario hacer nada, el algodón permite el traspaso del vapor al interior del tubo) y coloquenlo a fuego bajo. En el caso de usar la olla a pressión, se deben contar 15 minutos desde que la válvula libera vapor de agua puro (sin aire). De esta manera, nos aseguramos que los tubos están estériles. Si no se tiene una olla a presión, coloquenlo en un recipiente cerrado por aproximadamente el mismo tiempo. Recuerden que debería también tener alguna manera de librerar el vapor para evitar presiones altas sin control. Yo lo hice de esta manera y tuve una ocurrencia de hongos del 16% (y, en algunos casos, la semilla creció de todas formas). Luego del procedimiento, abran la olla o cacerola y, si están usando tubos con tapa a rosca, cierrenlos firmemente lo antes posible. Dejenlos enfriar a temperatura ambiente y listo!

Nota: Como veran en las imágenes, mis tubos no están verticales ya que mi olla no me lo permite, por lo que los coloqué inclinados, elevando la parte superior de los tubos, para evitar pérdida de agar-agar.

Step 4: Preparing the Seeds / Preparacion De Las Semillas

Picture of Preparing the Seeds / Preparacion De Las Semillas

Before sowing, we should prepare the seeds. If you bought them, they'll come dried, so we must hydrate them first. I did this by putting them in a petri dish with water for about 2 hours. If you don't have a petri dish it's OK, it's not necessary, I just used it because it's useful and I already had some.

Once the seeds are hydrated, we shouldn't forget that they aren't sterile and they may also contaminate our medium, so we should treat them first. To do this, we remove all the water and pour instead, over the seeds, 3% (or 10 volume) peroxide. We must keep them in this liquid for about 15 minutes and then we're ready to sow!

Antes de sembrar, debemos preparar las semillas. Si las compramos, vienen secas, por lo que tenemos que hidratarlas primero. Yo lo hice colocándolas en una placa de petri con agua por aproximadamente dos horas. Si no tienen una placa de petri no importa, no es necesaria, yo las use porque las tenía y me resultan cómodas.

Luego de que las semillas están hidratadas, no debemos olvidar que no son estériles y también pueden tener algo que contamine nuestro medio, por lo que debemos tratarlas primero. Para hacer esto, tiramos el agua y las colocamos en agua oxigenada al 3% (o 10 volúmenes). Debemos mantenerlas en este líquido por aproximadamente 15 minutos y ¡ya estamos listos para sembrar!

Step 5: Sowing! / a Sembrar!

Picture of Sowing! / a Sembrar!

Here comes the tricky part. The objective is to place the seed over the agar-agar (not below or inside it), but it's not as easy as it sounds, because the seed would be wet and sticky, the tube mouth is narrow and all of this should be done in a sterile environment. So, how we do it?
Well, there's something "magic" called the "sterility cone". Theoretically, from the highest point of the flame to the surface where it's placed, there's a cone of sterility and, if we work inside it, we will maintain the sterility of our tubes, seeds and tools.
Also, we're going to need something long, thin and made of steel to sow the seeds inside the tube, and some alcohol. I've used a little screwdriver. It should be made of steel because we will need to burn it to sterilize it.
Finally, if you have some latex gloves, use them, if not, it doesn't matter, just wash your hands with alcohol and try not to touch anything with your naked fingers.
So, the procedure is something like this:

1) Submerge the steel end of the screwdriver in alcohol and burn it in the flame. It should burn for a few seconds and then evaporate completely. Beware, if the handle of the screwdriver is made of plastic, it could melt. Also, if you washed your hands with alcohol, wait until they are dry before getting near any open flame.

2) Place the seed in the the tip of the flamed screwdriver, with the help of tweezers, an exacto knife, another screwdriver or whatever you have around, just be sure that you also flamed it. It should stick there, because of the water in the peroxide solution.

3) Open the tube below the sterility cone of the flame and insert the screwdriver in the mouth of the tube, trying not to touch the walls. Place the seed over the agar-agar, remove the screwdriver and close the tube.

That's it! It sounds harder than it actually is. Just remember to do everything under the sterility cone and sterilize your tools every time you do this procedure.

Acá viene la parte complicada. El objetivo es colocar la semilla sobre el agar-agar (no debajo ni dentro de el), pero no es tan sencillo como parece, ya que la semilla va a estar húmeda y pegajosa, la boca del tubo es angosta y todo esto debe ser realizado en un ambiente estéril. Entonces, ¿cómo lo hacemos?
Bueno, hay algo "mágico" llamado "cono de esterilidad". Teóricamente, desde el punto más alto de la llama hasta la superficie donde está apoyada hay un cono de esterilidad y si trabajamos dentro de el, mantendremos la esterilidad de los tubos, las semillas y las herramientas.
Aparte, vamos a necesitar usar algo largo, fino y de metal para sembrar las semillas dentro del tubo, y algo de alcohol. Yo usé un pequeño destornillador. Debe estar hecho de metal ya que necesitaremos quemarlo para esterilizarlo.
Finalmente, si tienen guantes de latex, usenlos. Si no, no importa, simplemente enjuagen sus manos con alcohol y traten de no tocar nada con sus dedos desnudos.
El procedimiento sería algo así:

1) Sumergir el extremo de metal del destornillador en alcohol y quemarlo en la llama. Debería arder por unos segundos y luego evaporarse completamente. Cuidado, si el mango del destornillador está hecho de plástico podría derretirse. También, si lavaron sus manos con alcohol, esperen a que estén secas antes de acercarse a cualquier llama.

2) Coloquen la semilla en la punta del destornillador flameado con la ayuda de pinzas, un cuchillo, un cutter u otro destornillador, o lo que sea que tengan a mano. Simplemente recuerden flamearlo también antes de usarlo. La semilla debería pegarse a la punta del destornillador gracias a el agua de la solución de peróxido.

3) Abran el tubo debajo del cono de esterilidad de la llama e inserten el destornillador en la boca del tubo, tratando de no tocar las paredes. Coloquen la semilla sobre el agar-agar, saquen el destornillador y cierren el tubo.

Listo! Suena más complicado de lo que es, simplemente acuerdense de hacer todo debajo del cono de esterilidad y de esterilizar sus herramientas cada vez que realizan el procedimiento.

Step 6: Now, Let's Wait... / Ahora, a Esperar...

Picture of Now, Let's Wait... / Ahora, a Esperar...

Now you should place the tubes in a warm place and wait. There are, in my opinion, a lot of advantages with this procedure:

1) You're sure that the seed will have everything it needs: water, food and oxygen (remember to keep the cap loose, but not completely open).

2) As we said, you don't need to water them!

3) You can see the progress of every individual seed, which is very helpful if you're trying to show it to the kids.

The time of germination will depend strictly on the seed. In my case, I saw the first indications of growing in the third day. By the 15th day, 60% of the tomatoes and 20% of the peppers were actually growing!
I had to transplant a few to cans with soil to give them more room to grow, because the tube will only help them with the first part. Later I'll place them in the garden.
That's it, I hope you enjoyed it and please, comment if you want!


Ahora solo resta colocar los tubos en algun lugar cálido y esperar. En mi opinión, existen un monton de ventajas con este procedimiento:

1) Estás seguro de que las semillas tendrán todo lo que necesitan: agua, alimento y oxígeno (recuerden mantener las tapas sueltas, pero no completamente abiertas).

2) Como dijimos, ¡no es necesario regarlas!

3) Se puede ver el progreso de cada semilla individualmente, lo que es muy util si se le quiere mostrar el proceso a los niños.

El tiempo de la germinación va a depender estríctamente de cada semilla. En mi caso, vi los primeros indicios de crecimiento en el tercer día. Para el día 15, el 60% de los tomates y el 20% de los pimientos ya estaban creciendo!
Tuve que transplantar algunas a latas con tierra para darles más espacio para crecer, ya que el tubo solo las ayuda con la primera parte. Luego, planeo pasarlas directamente al jardín.

Bueno, eso es todo, espero que lo hayan disfrutado y, por favor, comenten si quieren!

Comments

Hecco Davva (author)2016-05-18

primero que nada felicidades muy bien explicado, segundo me queda la duda de como transplantar a la tierra, tengo que sacar la semilla ya germinada con todo y el agar? o como? Gracias

lomeli_martha (author)2014-05-22

Me encanto... gracias por compartir

P1NCH0 (author)2011-02-06

Muy buena guía, gracias.
Se podrían utilizar semillas más grandes, ¿no? Estaba pensando en plantar una semilla de mango usando este sistema. Y, ¿se le puede añadir algún estimulante de creciminto de raíces a base de hormonas?
Porcierto, en la versión española no has puesto la parte de añadir el fertilizante al medio.

Gracias

SentencedToLive (author)P1NCH02011-02-06

Es cierto, gracias por la aclaración, ya lo corregí!
Si, se puede hacer con semillas más grandes, ahí conviene usar, obviamente, envases más grandes, los de gatorade o de ese estilo son muy útiles para este propósito. Teóricamente, se le puede agregar cualquier cosa al agar-agar que uno quiera que esté disponible para la semilla al momento de crecer. Nunca intenté con algo así pero no veo porque no podría ser. Si haces la prueba decime como salió!

P1NCH0 (author)SentencedToLive2011-02-06

ok, gracias por la respuesta, lo intentaré en cuanto tenga una semilla de mango.
Pero los envase de gatorade son de plástico ¿no se fundirán con el cono de fuego?

SentencedToLive (author)P1NCH02011-02-06

Claro, debí aclarar que yo estoy en Argentina. Aqui son de vidrio. Deberías estar bien con un frasco convencional con tapa a rosca. Una aclaración, el cono de esterilidad (no de fuego) es por debajo de la llama, no se supone que la toquen!

P1NCH0 (author)SentencedToLive2011-02-07

Aaaah... vale... muchas gracias por la aclaración.
Y una dad más sobre el del estimulante de raices: el que yo tengo es a base de hormonas. La mayoría de las hormonas spn proteínas (no se si este es el caso, supongo que si) y las proteínas son extremadamente sensibles a cambios en temperatura. Por lo que no creo que se pueda añadir al medio antes e la esterilización. ¿Que hago? ¿le añado el polvo a la semilla y luego la añado? Se supone que ha de hacerse así, pero supongo que eso comprometerá la esterilidad del medio.

Muchas gracias otra vez.

SentencedToLive (author)P1NCH02011-02-07

No todas las hormonas son peptídicas (compuestas por aminoácidos). En el caso particular de las fitohormonas, las más comunes (ABA, IAA, CK, GA) no son peptídicas. Por otro lado, no todos los péptidos y proteinas son inestables a altas temperaturas (de hecho, la gelatina y el agar-agar están compuestos de proteinas). Estas fitohormonas son comunmente estables a altas temperaturas (> 250ºC).
Ahora, con respecto a la forma de administrarlas, yo también tengo entendido que se supone que se impregne la semilla con el polvo en lugar de disolverlo, aunque también tenés otras líquidas. Incluso hay algunos que las disuelven en el agua de riego.
En definitiva, no creo que haya problema entonces en disolverlo en el medio y luego esterilizarlo!

P1NCH0 (author)SentencedToLive2011-02-08

Muchísimas gracias por las aclaraciones

Mr. E Meat (author)2011-01-06

Nice Instructable!

What sort of experiments would you need to start seedlings on agar for? I understand the Instructable but not the purpose.

Could you please explain the "sterility cone" better? Maybe post a diagram...

Well, I thought of it like a variant of the hydroponics principle, that is, growing a plant without soil, providing the nutrients and the water and the support media, in this case, agar-agar.
In my case, I use this routinely as a seedbed, due to lack of space and the cold temperatures in the outside. Once it grows, I transplant the seed to a pot with soil.
The advantages over a seedbed is that you don't need to water it and you can see if the seed is growing or not after some time. If it doesn't, you can always reuse the agar-agar, as long as you work in a sterile environment.
You can always scale it up, using a big container instead of the tubes, like a jar, and keep it there permanently. In that case, you should review the needs of nutrients and water, I really don't have data about that kind of experiment, but I've seen it and it works.
Lastly, I think it has and interesting educational aspect, it's very clear and graphic for a kid or a student who wants to learn how things actually take place.

About the sterility cone, here's a video:

http://www.youtube.com/watch?v=_UTDtqwUjgU

There you'll be able to see the basic principles of the aseptic technique in a practical way. To keep it simple, you should work near the flame all the time, the heat of the flame will create a convection current that will prevent potentially contaminating particles from falling into the agar.
Thanks for your comment!

Thanks for the response! That clears up a lot for me. I may just try starting some seedlings in agar for my garden this year!

lobo0x7 (author)2011-01-04

está muy bien explicado y no conocía el truco ese del cono de la llama.
tengo una duda:
parece un poco contradictorio tener tanto cuidado en la siembra para evitar la contaminación y luego se dejar los tapones semiaabiertos, no?
un saludo

SentencedToLive (author)lobo0x72011-01-04

Si, parece contradictorio, pero en realidad al ser de tapa a rosca se mantiene la esterilidad. Es decir, el tubo se sella cuando la parte flexible que se encuentra en el fondo del tapón presiona contra la boca del tubo, al girar la rosca hasta el tope. Al dejarlo flojo, o sea, no completamente sellado, logramos que al menos haya un poco de intercambio de aire entre el interior y el exterior del tubo, pero este aire debe atravesar toda la rosca para ingresar, por esto es que las probabilidades de contaminación son mínimas, ya que cualquier bacteria o espora de hongos debería atravesar el mismo camino y es más probable que nunca llegue. Si se usan tapones de algodón, éste al ser poroso produce un efecto similar. Gracias por el comentario!

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Bio: Chemistry Technician, some background in electronics and informatics, actually working in an pharmaceutical laboratory.
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